Células Natural Killer: Asesinas por Naturaleza (45)

Célula NK atacando una célula cancerosa

Las células natural killer (NK) son una tercera población de linfocitos, diferentes a los linfocitos B y linfocitos T y pertenecen al sistema inmune innato (SII). Provienen de la médula ósea y se encuentran en la sangre y tejidos linfáticos, especialmente el bazo; se caracterizan morfológicamente por ser mayoritariamente linfocitos grandes con gránulos citoplasmáticos(1,2). Su fenotipo característico en reposo es: TCR^-,BCR^-,CD3^-,CD16⁺,CD56⁺ (tabla 1); es decir, no presentan los receptores de los linfocitos del sistema inmune específico (SIE). Son una sub-población altamente heterogénea, cuyas principales funciones son la citotoxicidad y la secreción de citoquinas(2-4). Las células NK se activan a través del contacto con células sensibles o células blanco o por la acción de mediadores solubles, principalmente citoquinas.

Citotoxicidad mediada por las células NK. La función citotóxica es la más reconocida de éstas células y la ejercen sobre diferentes tipos celulares: células tumorales, células transformadas por virus, células infectadas con bacterias y otros patógenos, lo que les confiere un amplio papel defensivo, frente a enfermedades neoplásicas e infecciosas(2,5). La citotoxicidad mediada por las células NK es de dos tipos:

a) Citotoxicidad natural, la ejercen sobre células a través de un reconocimiento aun no del todo comprendido, pero que es espontáneo y no requiere activación previa. Este tipo de citotoxicidad, es además independiente del reconocimiento antigénico mediado por los receptores específicos del antígeno presentes en los linfocitos T y B, y de los complejos mayores de histocompatibilidad (MHC) presentes en las células presentadoras del antígeno(3,6); aun cuando, como se verá a continuación, este concepto está empezando a cambiar.

b) Citotoxicidad dependiente de anticuerpos (ADCC), que ha sido la más estudiada y es dependiente del receptor Fc de baja afinidad de inmunoglobulinas de tipo G, RFcg o CD16, el cual funciona reconociendo la fracción Fc de los anticuerpos que recubren a la célula blanco lo que les permite activarse y lisar a la célula blanco(3,6). La molécula CD56, es una molécula de adhesión cuyos ligandos o bien anticuerpos anti-CD56 no provocan la activación de éstas células. Los mecanismos utilizados para lisar a las células blanco los podemos también resumir en dos tipos: mecanismo membranolítico y mecanismo de muerte celular programada o apoptosis; generalmente en la lisis de cualquier determinada célula blanco ocurre una mezcla de los dos. El mecanismo membranolítico se caracteriza por la secreción de componentes citotóxicos de los gránulos de las células NK, post-contacto con la célula blanco, como la proteína formadora de poro o perforina, que forma poros en la superficie de la célula blanco, además se secretan granzimas, que son enzimas proteolíticas que se encuentran en los gránulos(2,3). El mecanismo de apoptosis, descrito más recientemente, se basa en la interacción principalmente de la proteína FasL, (CD95L), inducida post-contacto con la célula blanco, y Fas (CD95) que la debe expresar la célula blanco. La activación de Fas, inicia el mecanismo de apoptosis en la célula blanco(3).

Si bien la citotoxicidad natural mediada por las células NK es un hecho conocido, los mecanismos que intervienen en esta acción no lo son aún. Se han descrito muchos receptores que permiten la activación de las células NK, o sea receptores que al ser activados ponen en marcha la maquinaria citotóxica de estas células, algunos de los cuales junto a las propiedades generales de las células NK humanas aparecen en la(Tabla 1 - 3,6); sin embargo, la mayor especificidad en el reconocimiento de la célula blanco ha provenido de los receptores de inhibición de las células NK6. Estos receptores se caracterizan por interactuar con diversos tipos de complejos de histocompatibilidad clase I, MHC-I, transmitiendo una señal de inhibición de la citotoxicidad que prima sobre la activación. Esto quiere decir que si se enfrentan receptores de activación e inhibición simultáneamente, la respuesta es de inhibición de la citotoxicidad(6). Existen dos grandes familias de estos inhibidores, los de tipo lectinas, cuyo principal exponente es CD94/NKG2A y los del tipo similar a inmunoglobulinas, cuyos principales ejemplos son los denominados KIR (Killer inhibitory receptor)(6). Las células NK reconocen determinados segmentos de estos complejos y no es totalmente claro si es necesario para ello la existencia del péptido antigénico. Estos últimos resultados dan un fuerte apoyo a dos de las acciones más reconocidas de las células NK como son las actividades anti-virales y anti-neoplásicas. En ambas situaciones, y por mecanismos diferentes, puede disminuir la expresión de los MHC, es decir se remueve la señal inhibitoria, lo que deja libre la posibilidad de activación y lisis (Figura 1). Esta menor presentación antigénica por parte de las células tumorales o transformadas por virus, representa uno de sus principales mecanismos de evasión de la respuesta inmune específica.

Se ha observado además, por análisis in vitro, que muchas células tumorales expresan tipos de MHC-I que los protegen de la lisis de las células NK en base al mecanismo mencionado, situación que se está empezando a incorporar como una nueva posibilidad de evasión de la respuesta inmune(7).

FIGURA 1. La activación conjunta de receptores de activación y de inhibición de las células NK resulta en inhibición de la citotoxicidad. A.- Reconocimiento del MHC-I, por el receptor de inhibición, inhibe el mecanismo lítico protegiendo a la célula hospedera de la lisis aún cuando esté también activado el receptor de activación. B.- Si la célula blanco pierde o se altera la expresión del MHC-I, se pierde la acción inhibitoria, prevaleciendo la acción citotóxica. 

MHC-I y péptido antigénico Ligando Activador. 
Receptor de inhibición Receptor de activación.

Secreción de citoquinas. Las células NK al ser activadas secretan diferentes citoquinas al medio (Tabla 1 - 2,4,9), este mecanismo les permite participar en múltiples respuestas defensivas fisiológicas o patológicas. Se ha demostrado la existencia de dos subtipos de células NK: NK1 y NK2, que secretan diferentes patrones de citoquinas, que en algunos casos se repiten, pero que destacan en las NK1 la expresión de IFN-g y en las NK2 IL-5, lo que sugiere un posible papel diferencial en la respuesta inflamatoria innata y en sus efectos sobre la respuesta adaptativa(4).

Células NK y respuesta innata anti-infecciosa. La acción del SII, como mecanismo defensivo contra una gran variedad de microorganismos patógenos, ha ido adquiriendo un creciente interés en el último tiempo. Este mecanismo defensivo, que es previo a la participación del SIE, tiene la capacidad no sólo de iniciar la respuesta defensiva contra los microorganismos patógenos, sino que también la de guiar a la respuesta específica posterior(8,9). Son muchos los elementos participantes; células como macrófagos, neutrófilos y células NK, y los mediadores liberados por éstas células. Estos mediadores, especialmente las denominadas citoquinas innatas, producidas por el SII, son las principales encargadas de estimular la respuesta inicial y la posterior respuesta específica(8,9).

La importancia del SII radica en que aun cuando este sistema puede ser incapaz de eliminar a los patógenos, logra por un lado atenuar su proliferación y además generar las señales de peligro adecuadas que permitan la participación del SIE, y ambos en conjunto, erradicar al patógeno.

La participación anti-microbiana de las células NK, se puede resumir en sus dos principales funciones antes mencionadas:

a) Secreción de citoquinas: acción de citoquinas innatas. Aun cuando la función más característica asociada a las células NK es la citotoxicidad, en el caso de su actividad anti-microbiana resulta fundamental la función secretora de citoquinas, principalmente en respuesta a la acción estimuladora de la IL-12. La descripción y participación de la IL-12 que presenta un papel central en la inter-relación SII–SIE ha sido uno de los casos más estudiados. La molécula de IL-12 es un heterodímero de 70 kDa (p70) formado por dos cadenas polipeptídicas glicosiladas de aproximadamente 40 y 35 kDa(8). Esta conformación ya la convierte en una citoquina excepcional, pues la gran mayoría de las citoquinas son cadenas polipeptídicas únicas y de bajo peso molecular. La IL-12 es producida por células fagocíticas, células dendríticas, células de Langerhans y linfocitos B(9,20). Su producción por parte de los monocito/macrófagos y otras células presentadoras de antígeno, es fuertemente estimulada por algunos tipos de bacterias, productos bacterianos, parásitos intracelulares y virus y además por la interacción específica entre la célula presentadora del antígeno (CPA) y los linfocitos T, en que la interacción CD40–CD40L resulta esencial(9).

Entre las principales funciones de la IL-12 se pueden mencionar: i) la inducción de la síntesis de IFN-g por parte de las células NK y células T; esta acción requiere además la cooperación de otras citoquinas pro-inflamatorias innatas como IL-1ß, TNF-a, IL-15, requeridas para una óptima producción de IFN-g(8,9); el IFN-g activa a su vez a los macrófagos, permitiéndoles deshacerse de los patógenos intracelulares mediante no sólo el aumento de su actividad fagocítica y bactericida, con la mayor producción de metabolitos reactivos del oxígeno y óxido nítrico (NO), sino que también aumentando la capacidad de los macrófagos de producir IL-12, generando una muy efectiva retroalimentación positiva, (Figura 2, Etapas I y II)10. ii) La inducción de una respuesta específica de tipo T "helper" 1 (Th1); la presencia, en este caso, de IL-12 e IFN-g, durante el proceso de expansión de las células T, influye la capacidad de las células Th a diferenciarse hacia la serie Th1, que es la efectiva en la resistencia a patógenos intracelulares(8,20).

La participación de las células NK es relevante en los primeros eventos de la respuesta defensiva, y ocurre a través de la secreción de IFN-g, que como ya se mencionó provoca la activación de los macrófagos y el desarrollo preferencial de la respuesta antígeno específica mediada por los linfocitos Th1. Mientras las células NK, son inicialmente la fuente de IFN-g, esta citoquina es masivamente producida posteriormente por la respuesta inmune específica a través de los linfocitos T CD4 y CD8(8). Entre los ejemplos mejor conocidos que responden de acuerdo a este patrón, en modelos animales, se encuentran las infecciones provocadas por Listeria monocytogenes, Mycobacterium bovis, Toxoplasma gondii y el producto bacteriano lipopolisacárido (LPS)(8,9,11). Además in vitro, células sanguíneas mononucleares, que producen muy bajas cantidades de IL-12, aumentan significativamente esta producción por la estimulación bacteriana (S. aureus, preparaciones de estreptococo, como OK432, Mycobacterioum tuberculosis, Salmonella typhi) y por LPS(12,13). La IL-12 participa en la generación de la respuesta específica Th1, que son células productoras de IFN-g e IL-1, favoreciendo la inmunidad mediada por células, la activación de los macrófagos y la generación de anticuerpos opsonizantes. Los mismos monocito-macrófagos productores de las citoquinas pro-inflamatorias, producen también las citoquinas antiinflamatorias IL-10, TGF-ß e IL-6. Estas citoquinas en general atenúan la respuesta del macrófago activado, oponiéndose a la acción de las citoquinas pro-inflamatorias. El éxito por lo tanto de la respuesta inmune, dependerá del resultado del balance entre la producción de citoquinas pro-inflamatorias y antiinflamatorias.

b) Citotoxicidad. La citotoxicidad natural de las células NK puede ser estimulada por diversos factores en el proceso infeccioso bacteriano. En primer lugar, por las citoquinas derivadas de los macrófagos, especialmente IL-12 y 14; además, el contacto directo con diversas bacterias puede estimular la citotoxicidad de las células NK incluso hacia células normalmente resistentes a su acción(13,15). Por otra parte, se sabe desde hace mucho tiempo que las células NK lisan más eficientemente a las células infectadas por bacterias que a sus contrapartes no infectadas. Células como fibroblastos o macrófagos infectados con Listeria monocytogenes, Mycobacterium avium, Legionella, Salmonella(16,18), son lisados por las células NK con la consecuente liberación de los patógenos intracelulares, quedando por lo tanto expuestos a todos los mecanismos anti-microbianos extracelulares. Es muy probable entonces que durante el proceso infeccioso ocurra una acción mixta de estimulación: por un lado las citoquinas liberadas y conjuntamente la acción directa del patógeno.

Se analizará brevemente el papel de las células NK en dos patologías infecciosas importantes, como el shock séptico y algunas infecciones virales, escogidas porque los autores han participado en investigación en estos temas.

Shock séptico. Pese a que aún existen muchos vacíos en la comprensión de este síndrome, el esquema de la Figura 2, (Etapas I, II y III) aporta los elementos que permiten un análisis inicial integrado basado en el conocimiento del SII.

FIGURA 2. Esquema general de los primeros eventos de la participación de parte del sistema inmune innato en respuesta a la acción de microorganismos patógenos (Etapas I y II). Etapa I, acción de los patógenos sobre los macrófagos; Etapa II, activación y secreción de citoquinas por parte de las células del SII. La etapa III, representa la etapa final, derivada de la persistente acción de las dos etapas anteriores y la generación de diferentes mediadores endógenos causantes de daño a células y tejidos. Citoquinas y schock séptico. Este cuadro se produce a consecuencia de la complicación de una infección severa producida por diversos agentes infecciosos; en el caso de la infección bacteriana es ya un hecho establecido la participación de diversos mediadores endógenos, destacando la elevación plasmática de un gran número de citoquinas: IL-1-ß, IL-6, 8, 10, 12, 15, 18; TNF-a e IFN-g derivados de los macrófagos, linfocitos y células NK por acción bacteriana o de productos bacterianos(9,19,20). Esta participación ha sido demostrada en base a los siguientes hechos: a) la administración intravenosa de algunas de estas citoquinas, induce un cuadro similar al shock séptico en animales y humanos(19). b) La utilización de anticuerpos anti-citoquinas o de otros productos como receptores solubles para citoquinas o de antagonistas del receptor de citoquinas han dado promisorios resultados en modelos animales de sepsis en los cuales muchas variables pueden ser controladas, tales como: cepas genéticamente puras e inducción de sepsis por dosis y tiempos de respuesta controlados de bacterias o productos bacterianos; sin embargo, en la patología humana esto no ha sido posible; además de la gran variabilidad del agente causante y de la respuesta individual, los pacientes tienen patologías asociadas diferentes y tratamientos farmacológicos diferentes. En muchos casos, el cuadro de shock séptico se manifiesta con endotoxemia negativa, pues bastaría una muy baja cantidad de endotoxina unida a su proteína ligante para desarrollar la masiva respuesta observada en esta patología. De este modo la cinética de expresión de las citoquinas puede ser muy variable y por lo tanto resulta de una alta complejidad la utilización de inmunoterapia. La inmunoterapia hasta ahora utilizada se ha basado principalmente en los anticuerpos monoclonales anti-LPS y anti-TNF-a(21,22), que no han tenido un efecto significativo como tratamiento en la patología humana. c) La administración de citoquinas anti-inflamatorias como tratamiento, que también han sido utilizadas con resultados positivos en los modelos animales(19). Si bien el aumento de la secreción de la gran diversidad de citoquinas antes mencionadas es un hecho concreto, no ha sido clara la correlación entre el alza de determinadas citoquinas, la magnitud de este aumento y la gravedad del cuadro, en general el el aumento simultáneo de TNF-a, IL-1ß e IL-6 aparece como de mal pronóstico(25). Particularmente interesantes resultan también algunos modelos animales como el de la reacción de Shwartzman generalizada; se sabe en esta relación que una primera dosis intradérmica de LPS, induce la producción de IL-12, la cual estimula la producción de IFN-g, presumiblemente por células NK, permitiendo a su vez la estimulación de los macrófagos, una segunda estimulación, i.v., de LPS provoca la masiva secreción de TNF-a e IL-1ß que median los efectos letales de este tratamiento(32). Otro modelo experimental lo representa la acción conjunta únicamente de citoquinas estimuladoras, como IL-2 e IL-12 o IL-12 e IL-15, que provocan un cuadro de shock muy severo y fatal en modelos animales(33). En ambos casos, la eliminación previa de las células NK, provoca una significativa mejoría del cuadro, sugiriendo un importante papel al IFN-g u otros mediadores producidos por éstas células citotóxicas(32,33). Inmunosupresión y shock séptico: Una situación paradojal observada en el shock séptico, es por un lado la muy alta producción de citoquinas, índice de una alta actividad de la respuesta inmune innata y específica, y por otro un cuadro general de inmunosupresión. Entre las principales evidencias en relación al shock séptico y a alteraciones en la respuesta inmune se encuentran: una menor respuesta a mitógenos de los linfocitos(27), disminución de la citotoxicidad de las células NK y ausencia de respuesta de estas células a inmuno-estimuladores in vitro(28,29). Alteraciones en la citotoxicidad de las células NK son también comunes en otras situaciones severas como estrés físico o sicológico y quemaduras graves(30,31) desconociéndose en gran parte los mecanismos implicados en esta inmunosupresión. Es precisamente este fenómeno de inmunosupresión uno de los aspectos más estudiados actualmente. Las células productoras de citoquinas, especialmente los macrófagos van sufriendo una suerte de agotamiento a medida que progresa el shock séptico, su grado de activación y secreción frente a diversos estímulos in vitro demuestra una progresiva disminución de la respuesta(23). De hecho, monocitos aislados de voluntarios normales luego de exposiciones experimentales a LPS in vivo, o bien de monocitos aislados de pacientes con shock séptico provocada por gérmenes Gram negativos, tienen una reducida capacidad de secretar citoquinas pro-inflamatorias ex vivo; situación que también puede ser reproducida totalmente in vitro(23,24,26,34). Este fenómeno, en el caso del LPS que ha sido el más estudiado, se denomina tolerancia al LPS. Esta tolerancia, por lo tanto, puede provocar protección al desarrollo del shock séptico; sin embargo es una situación de alto riesgo frente a una segunda infección, por lo cual estos pacientes presentan un elevado riesgo de muerte por infecciones secundarias. Este estado "hipo-inflamatorio" derivado del shock séptico, también se ha denominado "parálisis inmunológica", indicativo de la severidad del cuadro. El fenómeno de tolerancia, puede ser explicado por una menor producción de citoquinas pro-inflamatorias, especialmente IL-12, situación que se ha observado también in vitro, en pacientes con shock séptico(26,34). Dado el papel pivotal de la IL-12 en la orquestación de la respuesta innata y adaptativa en respuesta a múltiples patógenos (Figura 2), la supresión de ésta citoquina es de una considerable significación patológica(26,34). Las acciones nocivas de niveles elevados de las citoquinas sobre diversos sistemas es también un hecho establecido y que ha sido ampliamente tratado(1). Un efecto que empieza a llamar la atención, sobre todo para explicar efectos patológicos de estos mediadores, es su acción inhibitoria y nociva sobre las células del sistema inmune propiamente tal y que podría explicar, al menos en parte, la inmunosupresión observada. Las citoquinas anti-inflamatorias IL-10 y TGF-ß, inhiben a los macrófagos, y linfocitos T; a las células NK sólo TGF-ß las inhibe, lo que apoya el efecto inmunosupresor observado(1,20,35). La persistente acción estimuladora de algunas de las citoquinas provoca en las células NK inactivación y muerte celular36; así, el efecto conjunto in vitro de IL-12 e IL-15 o IL-2 e IL-12 por ejemplo, provoca esta respuesta que finalmente permite explicar el hecho fundamental de eliminar a las células citotóxicas activadas a fin de evitar su acción sobre células normales(36). También los linfocitos T pueden sufrir activación y muerte celular, fenómeno denominado activación que induce muerte celular AIMC, en este caso la repetida estimulación antigénica, favorecida por algunas citoquinas como IL-2, provocan la muerte celular por apoptosis, se sabe además, que el mecanismo de acción depende de la expresión de FasL (CD95L) en los linfocitos T1. Por lo tanto, las situaciones de activación de la respuesta inmune en general puede conducir a la alteración funcional o a la muerte celular; es decir, fenómenos descritos en el shock séptico y que nos permiten por lo menos dar una explicación de la inmunosupresión observada. Infecciones virales: La función y respuesta de las células NK se ha evaluado en el contexto de un amplio rango de infecciones virales. En general la respuesta a la infección viral por parte de las células NK es muy similar a la descrita para la infección bacteriana. Citotoxicidad y acción de citoquinas. Las células NK lisan más eficientemente a células infectadas y se activan por citoquinas liberadas por células infectadas(5). En la mayoría de los casos, se ha observado, a nivel experimental, un aumento de la actividad citolítica NK y de la producción de IFN-g dentro de las primeras horas o días en el caso de la infecciones primarias, mientras que las respuestas inmunes adaptativas son de más lenta aparición. La respuesta inicial de secreción de citoquinas es un hecho relevante en el inicio de la respuesta a la infección viral, si bien algunos virus responden generando IL-12 y la producción de IFN-g (Figura 2). La generación de IFNa/ß y otras citoquinas es también relevante en la estimulación de la citotoxicidad mediada por estas células. Inclusive el aumento de IFNa/ß puede inhibir la producción de IL-125. Recientemente en base a estudios in vitro se ha demostrado la importante participación de IL-15 como respuesta de los linfocitos sanguíneos periféricos a la infección por diversos tipos de virus, como herpes (HHV-6, HHV-7, HSV, EBV), virus respiratorio sincicial, virus de la estomatitis vesicular, virus influenza, reovirus y virus Sendai). En todos estos casos hay una significativa estimulación de la citotoxicidad de las células NK en respuesta a la IL-15. Esta citoquina la producirían principalmente los monocitos(44). El uso de modelos animales deficientes en células NK ha sido muy útil en el estudio del rol de éstas células en la defensa inmune contra múltiples agentes virales. Los estudios en humanos sugieren un rol vital de las células NK en la defensa del individuo contra el virus de inmunodeficiencia humana, herpesvirus, virus de hepatitis B y C, y otros virus. Se ha descrito un paciente que tenía una deficiencia relativamente selectiva de células NK, el cual sufrió infecciones virales secuencialmente con virus varicela zoster, luego citomegalovirus, luego virus herpex simplex(37). Por otra parte, diversas infecciones virales se han asociado con defectos inmunológicos transitorios o persistentes que involucran a las células NK. Así, por ejemplo, es conocido que post-sarampión se produce un estado transitorio de inmunosupresión que afecta principalmente a las células T, pero también esta infección viral puede anular la actividad funcional de las células NK(38). En sujetos con infección crónica por virus de Epstein Barr se han descrito defectos persistentes de la función de células NK, asociados a otros defectos inmunológicos, constituyendo este un buen ejemplo de una inmunodeficiencia secundaria causada por una infección viral(39). En la infección por citomegalovirus, se ha comunicado que algunos sujetos pueden tener números elevados de células NK circulantes, con actividad supresora in vitro(40). Recientemente, se ha descubierto que el virus herpes humano 6, agente causal de la roséola, infecta directamente las células NK, lo cual sugiere que en estos casos el virus puede suprimir el sistema inmune de manera significativa a través de este mecanismo(41). El rol de las células NK en la defensa contra el VIH-1 ha sido controvertido. Varios autores han demostrado una actividad citolítica natural deficiente en pacientes con SIDA y usualmente normal en pacientes portadores asintomáticos del VIH-1(42). En resumen, las células NK tienen un papel importante en la defensa anti-infecciosa a través de sus dos principales funciones, la citotoxicidad y la secreción de citoquinas. Este último aspecto aparece como el más relevante en la interacción del sistema innato con el sistema inmune específico. REFERENCIAS 1. 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